המרכז הארצי למורי ביולוגיהלוגו המרכז הארצי למורי ביולוגיהסנוניתהאוניברסיטה העברית בירושליםמל"מ

הפקת dna במעבדה הבית ספרית - נילי גילוני

להורדה כקובץ word

 שיטת העבודה מבוססת על מאמר' Spooling the Stuff of Life' מאת Carlson Shawn מתוך Scientiific American


במקום מבוא

אחד השלבים הראשונים והבסיסים בכל מחקר גנטי הוא שלב הפקת הדנ''א. במעבדה זו נפיק
דנ''א בדרכים פשוטות מאד ובאמצעים הנמצאים בהישג יד.
לפני תחילת העבודה נענה על מספר שאלות:

  1. מה יכול לשמש כמקור להפקת דנ''א?
    א. חלקי צמח שונים.
    ב. תאי אפיתל מהלחי בצדה הפנימי.
    ג. איברים שונים של בעלי חיים.
    ד. כל התשובות נכונות.

  2. מיין את המושגים שבתחתית הטבלה על פי רמות אירגון:

    רמת הארגון

     

    האורגניזם השלם

     

    איבר

     

    רקמה

     

    תא

     

    אברון

     

    מולקולה

     


            כלורופלסט , עגבניה, פרי, חומצות גרעין, גלד בצל, בננה, כרומוזום,דנ''א, ניצן, נוקליאוטידים,  מיטוכונדריה, תא אפיתל, גרעין התא, חלבונים, רנ''א, שומנים,
    ריבוזומים, שום הגינה, ציטופלסמה, בצל הגינה.


  3. לפניך איור של תא צמחי רשום את אברוני התא שהנך מכיר:


  4. סמן בעט צבעוני את האברונים המכילים דנ''א.

  5. מאילו חומרים עיקרים בנוי התא? מיין אותם למולקולות גדולות ולמולקולות קטנות/יונים

 

מולקולות גדולות

מולקולות קטנות ויונים

   

 

רגע לפני שממשיכים, חשבו כיצד הייתם ממצים דנ''א מרקמה?

 ועתה להסבר קצר על השיטה שלנו להפקת דנ'א: השיטה מורכבת מחמישה שלבים:

 שלב ראשון בו אנו מכינים בופר ומוסיפים לו דטרגנט: חומר הגורם לפירוק שומנים וחלבונים.

 שלב שני בו אנו שוברים את התאים

 שלב שלישי בו אנו מערבבים את רסק התאים המכיל את מוהל התאים וחלקי דופן עם הבופר
                  והדטרגנט וכך גורמים לפירוק שומנים וחלבונים.

 שלב רביעי בו אנו מכניסים את התמיסה לצנטריפוגה על מנת להפריד בין דנ''א המומס בבופר 
                לבין שברי התאים וחלקי התא שלא נשברו או התפרקו על ידי הדטרגנט.
                 (במידה ואין במעבדה צנטריפוגה נסנן את התמיסה דרך נייר סינון ללא ערבוב כדי 
                שרק הבופר עם המולקולות המומסות בו יסתננו)

 שלב חמישי בו נפיק את הדנ''א ומולקולות רנ''א מהתמיסה על ידי שימוש באלכוהול.
                  העכירות שתתגלה אלה הן מולקולות דנ''א שבסביבה הכימית שיצרנו נמשכו זו
                  לזו. בעזרת קיסם עץ נוכל להפרידן מהתמיסה.

בשיטה זו איננו מפיקים דנ''א נקי כי מצטרפות אליו גם מולקולות רנ''א. במעבדות מחקר
משתמשים באנזימים המפרקים רנ''א וכך מפיקים דנ''א נקי.

 

כלים וחומרים
לכל הכתה

 בלנדר
צנטריפוגה (אם אין בנמצא הוסף למגש הכלים את הפריטים המסומנים בכוכבית)
3 אמבט קרח כתוש 

לכל זוג

בצל יבש/בננה/שום/עגבנייה
2 פיפטה של 5 מ''ל
כף
כפית
כוס כימית בנפח 250 מ''ל
כוס כימית קטנה
2 מבחנות
מעמד למבחנות
מקל זכוכית
סכין
קיסם עץ ארוך (שיפודים)
מים מזוקקים
1 כפית סודה לשתיה
¼ כפית מלח שולחן
2 כפות דטרגנט.( פלמוליב לכלים 36% חומר פעיל או נוזל לכביסה במכונה)
10 מ''ל אלכוהול איזופרופינול 95%-99% . יש לשמור במבחנה סגורה במקפיא עד לרגע השימוש.

 *משפך קטן
*נייר סינון

מהלך העבודה:

שלב ראשון: הכנת הבופר.

מזוג לתוך הכוס הכימית 120 מ''ל מים מזוקקים. הוסף 1/4 כפית מלח שולחן, 1 כפית סודה לשתיה ו - 2 כפות דטרגנט. ערבב את החומרים בעזרת מקל הזכוכית. הכנס את הכוס הכימית עם תמיסת הבופר שהכנת לתוך אמבט הקרח.

שלב שני
: שבירת התאים של הרקמה החיה.
בחר מקור להפקת דנ''א (בצל הגינה, שום הגינה, בננה,עגבניות)
חתוך את הרקמה לחתיכות קטנות.
הכנס לבלנדר הוסף מעט מים והפעל למשך 10 שניות. ניתן לרסק את הרקמה בכותש שום.

 שלב שלישי: פירוק שומנים, וחלבונים בעזרת הדטרגנט.
א. שאב בעזרת פיפטה 5 מ''ל מהרסק של הרקמה והעבר לכוס כימית קטנה. הוסף 10 מ''ל של בופר קר.
ב. ערבב בקפידה בעזרת מקל זכוכית במשך 2 דקות לפחות.

 שלב רביעי: הפרדת חלקי התאים וחומרים שלא פורקו מהמיצוי בעזרת צנטריפוגה. במעבדות בהן אין צנטריפוגה יש לעבוד על פי שלב רביעי המסומן בכוכבית.
א. מזוג בזהירות את התערובת למבחנה והכנס לצנטריפוגה. הפעל את הצנטריפוגה במהירות נמוכה למשך 5 דקות.
ב. הוצא את המבחנה. הבחן במשקע בתחתית המבחנה. משקע זה מכיל חלקי תאים וחלקי דופן התא שלא פורקו על ידי הדטרגנט.
ג. שאב בעדינות בעזרת פיפטה 5 מ''ל מנוזל המיצוי. והעבר למבחנה רגילה. הקפד לא לגעת עם הפיפטה בתחתית המבחנה. . במידה ואין צנטריפוגה המשך על פי שלב רביעי *

*שלב רביעי
: הפרדת חלקי התאים וחומרים שלא פורקו על ידי הדטרגנט מהמיצוי בעזרת סינון דרך נייר סינון.
א. בעזרת משפך המרופד בנייר סינון, סנן את המיצוי לתוך מבחנה. תן לחומר לעבור דרך נייר הסינון מבלי לערבב ולהאיץ את התהליך .
ב. לאחר שנאסף מיצוי מסונן בתחתית המבחנה. שאב בעזרת פיפטה 5 מל' מהמיצוי והעבר למבחנה חדשה. סמן אותה כך שלא תתבלבל בהמשך עם המבחנה הקודמת.

 שלב חמישי: שלב הפרדת הדנ''א מהמיצוי.
המיצוי מכיל כעת מולקולות דנ'א וכן מולקולות אחרות : סוכרים, וחלבונים קצרים. בעזרת אלכוהול איזופרופינול בריכוז 95%-99% נפריד את מולקולות הדנ''א מהמיצוי.
א. שאב בעזרת פיפטה נקיה 10 מ''ל אלכוהול איזופרופינול מזוג את האלכוהול בעדינות ובאיטיות למבחנה המכילה את המיצוי. מאחר והאלכוהול בעל צפיפות נמוכה יותר מהמיצוי הוא יוצר שכבה מעל למיצוי. לשכבה זו מולקולות הדנ'א נמשכות וכן נמשכות זו לזו. כך ייווצר באזור בין נוזל המיצוי לאלכוהול כתם עכור.כתם זה הוא בעצם ריכוז גבוה מאד של מולקולות דנ''א אשר בתנאים הכימיים שיצרנו נמשכו זו לזו. בעזרת קיסם עץ ארוך תוכל למשוך את מולקולות הדנ''א אשר נדבקות לקיסם.
בשיטה זו איננו מפיקים דנ''א נקי אלא דנ''א ומולקולות רנ''א.
ב. במיצוי נשארו פרגמנטים קצרים של דנ''א שלא נדבקו זה לזה. על מנת לזהות את נוכחותם במיצוי ניתן לטפטף טיפה של האינדיקטור כחול מתילן. האינדיקטור נקשר אל המולקולות של דנ''א וכך ניתן לזהות את אותן המולקולות שלא נדבקו לקיסם העץ.

 

ביבליוגרפיה:

Carlson Shawn.J. Spooling the Stuff of Life. Scientific American, january 1998

 

אתר ובו מתכון נוסף להפקת דנ''א בצירוף הסברים ואיורים על השיטה (באנגלית) מומלץ לתת לתלמידים לנסות בבית.

http://gslc.genetics.utah.edu/units/activities/extraction/

 

כמה מילים למורה
השיטה נוסתה בהצלחה בבית. המקורות המומלצים להפקת דנ''א על פי סדר עדיפות:
-בצל יבש (הזורעים בדמעה...)
-שום
-עגבנייה - מראה דנ''א הצף בסוף התהליך מאד אסתטי (וכמובן הכי פחות ''ריחני'' ) אך כמות הדנ''א מעטה וקשה לדוג אותה בעזרת המקל.
-בננה לא נוסתה.

לגבי השימוש בכותש שום: אפשרי אך מלכלך נורא ומצריך השקעת יותר זמן על כתישת החומר החי.





מאגר חומריםהעלון למורי הביולוגיהחומרים למורים בלבדביודעקבוצות דיוןמה חדש באתרפינת המפמרכתבו לנומפת האתרקישוריםעל המרכז
 
 
חזרה

קבוצות דיון | ביודע | חומרים למורים בלבד | העלון למורי הביולוגיה | מאגר חומרים
לדף הראשי | מפת האתר | כתבו לנו | על המרכז | קישורים | מה חדש באתר? | פינת המפמ"ר
כל הזכויות שמורות © המרכז הארצי למורי ביולוגיה